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干貨分享 | 細胞凍存與復蘇避坑指南

更新時間:2025-01-08      點擊次數(shù):293
  細胞凍存和復蘇是細胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),直接影響細胞存活率和活力,關(guān)系到后續(xù)細胞實驗能否按照計劃有效地進行。要想做好細胞凍存和復蘇,首先請牢記下面這四個字:
 
  慢凍快融!
 
  1、為什么要慢凍快融?
 
  凍存細胞時,細胞內(nèi)外環(huán)境中的水會形成冰晶。如果直接將細胞凍存到 -196℃ 的液氮中,由于凍結(jié)過程中胞外溶液中的水先結(jié)冰,使胞外溶液不斷濃縮,引起細胞電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水及蛋白質(zhì)變性等,會導致細胞受到機械性損傷。
 
  2、細胞凍存-讓你細胞安心沉睡
 
  3、細胞復蘇-讓細胞滿血復活
 
  ■ 細胞拿取
 
  盡量減少樣品從液氮或 -80℃ 取出到放置在解凍裝置中之間被動升溫的時間,否則會大大影響細胞活力。如果儲存裝置和解凍裝置相隔較遠,可使用裝有干冰 (-80°C) 或液氮 (-196°C) 的隔熱容器臨時保存和運送細胞。
 
  復蘇后第二天發(fā)現(xiàn)細胞沒有活?好不容易復蘇的細胞竟然污染了?怎么才能讓細胞滿血復活呢?繼續(xù)和小 M 一起往下看吧!■ 細胞拿取
 
  盡量減少樣品從液氮或 -80℃ 取出到放置在解凍裝置中之間被動升溫的時間,否則會大大影響細胞活力。如果儲存裝置和解凍裝置相隔較遠,可使用裝有干冰 (-80°C) 或液氮 (-196°C) 的隔熱容器臨時保存和運送細胞。(注意:從液氮中取細胞時要佩戴護目鏡和手套,謹防凍傷及凍存管爆炸!)
 
  ■ 解凍方式a) 解凍細胞時需要快速升溫 (50~100℃/min) 才能最大保存細胞活力,解凍方式是 37℃ 水浴[3]。從液氮或 -80℃ 取出凍存的細胞后,稍擰松管蓋,防止解凍過程中凍存管炸裂。放入 37℃ 水浴中,持續(xù)搖晃 1-2 分鐘直至解凍。
 
  通常建議在可見冰融化但樣品仍然冰冷(~0℃)時立即停止解凍,常見的做法是在只剩下一小片冰時從水浴鍋中取出樣品。升溫至室溫或更高溫度會增加冷凍保護劑的細胞毒性,這會極大影響細胞活力[1]。
 
  b) 不建議室溫解凍細胞,因為這會導致細胞死亡。
 
  c) 為降低污染風險,水浴解凍時凍存管管口要高于水面,避免水流入凍存管,水浴鍋中的無菌水也要定期更換。
 
  ■ 稀釋
 
  解凍后應盡快稀釋,以減少 DMSO 的細胞毒性。按照培養(yǎng)基:凍存液 ≥10:1 的比例加入培養(yǎng)基進行稀釋,然后離心并更換培養(yǎng)基重懸細胞,這樣可以減少由滲透壓變化導致的細胞應激。
 
  ■ 換液
 
  依據(jù)細胞狀態(tài),在細胞貼壁后或 24 h 后換液,繼續(xù)培養(yǎng)。
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